Soal agama, Nikki sering disebut sebagai penganut Yahudi. Namun, dia menyangkalnya dan mengaku dibesarkan dengan keyakinan Katolik.
Saat masa kecilnya, Nikki banyak menghabiskan waktu di St. Louis, Missouri, di pinggiran Kirkwood. Setelah lulus dari Kirkwood High School, dia sempat kuliah di University of Colorado Boulder sebelum akhirnya pindah ke Universitas Kansas dan meraih gelar bidang sastra Inggris.
Beralih ke catatan karier, Nikki mengawalinya sebagai komedian tunggal sejak usia 18 tahun. Namanya mulai mendapat perhatian setelah tampil di acara seperti The Tonight Show with Jay Leno, Conan, dan Last Comic Standing. Sebagai komedian, Nikki punya gaya khas yang lugas, jujur, dan terkadang provokatif. Dia cukup hebat menunjukkan keahliannya dalam melontarkan lelucon tajam.
Selain stand-up, Nikki ikut pula merambah dunia akting. Pada awalnya, dia berkesempatan tampil dalam peran kecil di film seperti Punching the Clown (2009), Trainwreck (2015), Punching Henry (2016) hingga I Feel Pretty (2018).
Kemudian, Nikki juga sukses sebagai pembawa acara. Dia banyak memandu program televisi, seperti Nikki & Sara Live, acara komedi Not Safe with Nikki Glaser hingga program kencan Blind Date dan FBoy Island.